實(shí)時(shí)熒光定量PCR（一個(gè)極有效的實(shí)驗方法）
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實(shí)時(shí)熒光定量PCR
一個(gè)極有效的實(shí)驗方法
基本信息
| 中文名 | 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈式反應 |
| 外文名 | Real-timeQuantitativepolymerase chain reaction |
| 簡(jiǎn)稱(chēng) | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 外文簡(jiǎn)稱(chēng) | qPCR |
工作原理
所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR
SYBR定量PCR擴增熒光曲線(xiàn)圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)圖（單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性）
2.TaqMan探針?lè )ǎ?/span>
探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
技術(shù)原理
將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著(zhù)循環(huán)次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長(cháng)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時(shí)利用數個(gè)已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。
Ct 值
1. 熒光閾值（threshold）的設定
PCR反應的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J）設置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值與起始模板的關(guān)系
每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴增反應的循環(huán)次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時(shí)擴增產(chǎn)物的量。
起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光化學(xué)物質(zhì)
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結合，因此可以通過(guò)溶解曲線(xiàn)，確定PCR反應是否特異。
3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會(huì )產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。
傳統定量PCR
1．傳統定量PCR方法簡(jiǎn)介
（1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不用標記。在模板擴增的同時(shí)，內標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內標與靶模板的長(cháng)度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測定其熒光強度，以?xún)葮藶閷φ斩看龣z測模板。
（2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴增（其中一個(gè)引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過(guò)氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗，若加入內標，作出標準曲線(xiàn)，也可實(shí)現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用
由于傳統定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過(guò)對數期擴增到達平臺期時(shí)，檢測重現性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復實(shí)驗，所得結果有很大差異，因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．內標對定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時(shí)，這種競爭會(huì )表現得更為顯著(zhù)。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無(wú)法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個(gè)原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統定智能能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對每個(gè)樣品Ct值的計算，根據標準曲線(xiàn)獲得定量結果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內標是建立在兩個(gè)基礎之上的：
（1）Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期（對數期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時(shí)間擴增或同一時(shí)間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標準曲線(xiàn)定量的方法。
外標準曲線(xiàn)的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標準曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和絕對定量。
相關(guān)應用
臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實(shí)現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實(shí)現遺傳病診斷。
動(dòng)物疾病檢測
食源微生物、食品過(guò)敏源、轉基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。
科學(xué)研究
醫學(xué)、農牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應用行業(yè)
各級各類(lèi)醫療機構、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業(yè)及乳品廠(chǎng)等。
由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。
關(guān)于名稱(chēng)
根據MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）的指導方針，qPCR為Quantitative real-time PCR的簡(jiǎn)稱(chēng)，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR僅用來(lái)表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少數作者并沒(méi)有堅持這一原則。
檢測H7N9禽流感的主要方法
2013年春季，中國內地發(fā)生多起H7N9禽流感染人人類(lèi)事件，截至4月6日下午五時(shí)，全國共報告18例人類(lèi)感染，6人死亡。針對此次禽流感事件，對送檢樣本進(jìn)行H7N9檢測的方法共有兩種，一種是進(jìn)行核酸檢測，即采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對H7N9的特異性核酸進(jìn)行檢測；另一種一種就是對樣本進(jìn)行H7N9病毒分離鑒定，直接獲取毒株?！昂怂釞z測快速準確，是現在實(shí)驗室采用的主要檢驗方法?！睂?zhuān)家說(shuō)，H7N9特異性核酸檢驗耗時(shí)短，從完成樣本處理到最后獲取檢測結果，進(jìn)行確診，整個(gè)過(guò)程在3-5個(gè)小時(shí)內完成，可實(shí)現對病毒的快速診斷。
檢測過(guò)程分為三個(gè)步驟：對醫院采集樣本進(jìn)行標本處理，如果發(fā)現可疑病例，將由當地醫院專(zhuān)業(yè)的醫護人員進(jìn)行采樣，主要提取患者的咽拭子樣本或含漱液、鼻拭子、肺部清洗液的樣本，安全保存后送至實(shí)驗室開(kāi)展病毒檢測；提取病毒核酸，隨后與H7N9核酸檢測試劑配成反應體系，因為檢測試劑主要針對H7N9的特異性核酸片段會(huì )起反應?？梢哉f(shuō)，通過(guò)這個(gè)試劑能快速確定病人是否感染了H7N9禽流感病毒；放入熒光定量PCR儀做病毒核酸特異擴增，進(jìn)行熒光定量檢測，最后結果進(jìn)行檢測分析，判斷是否呈陽(yáng)性反應。
浙江省公共衛生檢驗檢測重點(diǎn)學(xué)科群首席專(zhuān)家、應急監測關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室主任盧亦愚教授，介紹了浙江省自行合成H7N9禽流感檢測試劑：
“H7N9禽流感檢測試劑被放置在食指大小的密封透明試管里。每套檢測試劑由6份EP管組成，包含白色的水滴形小管‘引物’，以及棕色小管‘探針’。引物和探針主要是針對H7N9特異性核酸片段。目前這些試劑被放在專(zhuān)用試劑盒中，放置在專(zhuān)用冰箱保存?！?/span>
“工作人員需要將檢測的結果，結合實(shí)驗時(shí)設置的陽(yáng)性、陰性對照進(jìn)行分析，只有陰性、陽(yáng)性結果成立，且樣本結果可靠時(shí)才能夠最終確定是否為H7N9禽流感病毒，一般來(lái)說(shuō)，檢測時(shí)間需3-4個(gè)小時(shí)?！?/span>
參考資料
[1]
在線(xiàn)講座：內參在real-time PCR病原體檢測中的應用 · 丁香通[引用日期2013-04-07]
[2]
浙江省疾控中心專(zhuān)家回答三大防控焦點(diǎn)問(wèn)題 · 新浪浙江[引用日期2013-04-07]
[3]
熒光定量PCR：簡(jiǎn)介，原理，應用 · 丁香通[引用日期2013-04-07]
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尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
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