毛細管區帶電泳法
【毛細管電泳】是以彈性石英毛細管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅動(dòng)力,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現分離的電泳分離分析方法。
【所用設備】主要部件有0~30kV可調穩壓穩流電源,內徑小于100μm(常用50~75μm)、長(cháng)度一般為30~100cm的彈性石英毛細管、電極槽、檢測器和進(jìn)樣裝置。檢測器有紫外/可見(jiàn)分光檢測器、激光誘導熒光檢測器和電化學(xué)檢測器,前者最為常用。進(jìn)樣方法有電動(dòng)法(電遷移)、壓力法(正壓力、負壓力)和虹吸法。成套儀器還配有自動(dòng)沖洗、自動(dòng)進(jìn)樣、溫度控制、數據采集和處理等部件。 毛細管電泳所用的石英毛細管柱,在pH值>3的情況下,其內表面帶負電,與緩沖液接觸時(shí)形成雙電層,在高壓電場(chǎng)作用下,形成雙電層一側的緩沖液由于帶正電而向負極方向移動(dòng),從而形成電滲流。同時(shí),在緩沖溶液中,帶電粒子在電場(chǎng)作用下,以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動(dòng),形成電泳。帶電粒子在毛細管緩沖液中的遷移速度等于電泳和電滲流的矢量和。各種粒子由于所帶電荷多少、質(zhì)量、體積以及形狀不同等因素引起遷移速度不同而實(shí)現分離。 目前,毛細管電泳的分離模式有以下幾種。
(1)毛細管區帶電泳,用以分析帶電溶質(zhì)。為了降低電滲流和吸附現象,可將毛細管內壁涂層。
(2)毛細管凝膠電泳,在毛細管中裝入單體,引發(fā)聚合形成凝膠,主要用于測定蛋白質(zhì)、DNA等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質(zhì),如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷,裝人毛細管中進(jìn)行分析,稱(chēng)毛細管無(wú)膠篩分電泳,故有時(shí)將此種模式總稱(chēng)為毛細管篩分電泳,下分為凝膠和無(wú)膠篩分兩類(lèi)。 (3)膠束電動(dòng)毛細管色譜,在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉,形成膠束,被分離物質(zhì)在水相和膠束相(準固定相)之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細管內遷移,達到分離。本模式能用于中性物質(zhì)的分離。 (4)親和毛細管電泳,在毛細管內壁涂布或在凝膠中加入親和配基,以親和力的不同達到分離目的。
(5)毛細管電色譜,是將HPLC的固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁涂布固定相,以電滲流為流動(dòng)相驅動(dòng)力的色譜過(guò)程,此模式兼具電泳和液相色譜的分離機制。
(6)毛細管等電聚焦電泳,是通過(guò)內壁涂層使電滲流減到最小,再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣,兩個(gè)電極槽中分別為酸和堿,加高電壓后,在毛細管內建立了pH梯度,溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自的等電點(diǎn),形成明顯區帶,聚焦后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值使溶質(zhì)通過(guò)檢測器。
(7)毛細管等速電泳,采用先導電解質(zhì)和后繼電解質(zhì),使溶質(zhì)按其電泳倘度不同得以分離。
以上各模式以(1)、(2)、(3)種應用較多。
電極槽和毛細管內的溶液為緩沖液,可以加入有機溶劑作為改性劑,以及加入表面活性劑,稱(chēng)作運行緩沖液。運行緩沖液使用前應脫氣。電泳譜中各成分的出峰時(shí)間稱(chēng)遷移時(shí)間。膠束電動(dòng)毛細管色譜中的膠束相當于液相色譜的固定相,但它在毛細管內隨電滲流遷移,故容量因子為無(wú)窮大的成分最終也隨膠束流出。其他各種參數都與液相色譜所用的相同。 一、對儀器的一般要求
所用的儀器為毛細管電泳儀。正文中凡采用毛細管電泳法測定的品種,其所規定的測定參數,除分析模式、檢測方法(如紫外光吸收或熒光檢測器的波長(cháng)、電化學(xué)檢測器的印加電位等)應按照該品種項下的規定外,其他參數如毛細管內徑、長(cháng)度、緩沖液的pH值、濃度、改性劑添加量、運行電壓或電流的大小、運行的時(shí)間長(cháng)短、毛細管的溫度等,均可參考該品種項下規定的數據,根據所用儀器的條件和預試驗的結果,進(jìn)行必要的調整。 二、系統適用性試驗
同高效液相色譜法項下,按各品種項下的要求,進(jìn)行預試驗,并調節各運行參數使達到規定指標,方可正式測定。
三、測定法
同高效液相色譜法項下。目前毛細管電泳儀的進(jìn)樣精度較高效液相色譜法低,定量分析時(shí)以用內標法為宜。