原核表達載體，能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細胞中進(jìn)行表達的載體。

定義

能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細胞中進(jìn)行表達的載體

載體調控原件

啟動(dòng)子

原核表達載體

啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列，它是基因表達不可缺少 的重要調控序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉錄。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開(kāi)且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉錄起始點(diǎn)上游5～10 bp處，有一段由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T的區域，稱(chēng)為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區。來(lái)源不同的啟動(dòng)子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉錄起始位點(diǎn)上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區域，稱(chēng)為-35區。轉錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識別并結合啟動(dòng)子。-35區與RNA聚合酶s亞基結合，-10區與RNA聚合酶的核心酶結合，在轉錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。原核表達系統中通常使用的可調控的啟動(dòng)子有Lac(乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現，在mRNA上有核糖體的結合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于A(yíng)UG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡(jiǎn)稱(chēng)SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結合也會(huì )影響mRNA與核糖體的結合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在A(yíng)TG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。

終止子

在一個(gè)基因的3￠末端或是一個(gè)操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉錄功能，這一序列稱(chēng)之為轉錄終止子，簡(jiǎn)稱(chēng)終止子(terminator)。轉錄終止過(guò)程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來(lái)。對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結構上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區域和一段富含G/C的區域，G/C富含區域又具有回文對稱(chēng)結構。這段終止子轉錄后形成的RNA具有莖環(huán)結構，并且有與A/T富含區對應的一串U。轉錄終止的機制較為復雜，并且結論尚不統一。但在構建表達載體時(shí)，為了穩定載體系統，防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩定性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉錄終止子。

表達載體構建

獲得目的基因

（1）通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

（2）通過(guò)RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

構建重組表達載體

（1）載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性?xún)惹忻福ㄍ锏拿盖形稽c(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

（1）將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

（2）測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

原核表達載體

（3）以此重組質(zhì)粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。