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激光掃描共聚焦顯微鏡
近代生物醫學(xué)圖象儀器
基本信息
| 中文名 | |
| 外文名 | Confocal laser scanning microscope |
| 別名 | CLSM |
| 電子產(chǎn)品類(lèi)別 | 儀器 |
| 用途 | 近代生物醫學(xué)圖象儀器 |
| 優(yōu)勢 | 增強對比度、提高分辨率 |
| 領(lǐng)域 | 光學(xué)成像技術(shù)手段 |
| 開(kāi)始發(fā)展時(shí)間 | 20世紀80年代中期 |
收起
發(fā)展沿革
激光掃描共聚焦顯微鏡（Laserscanningconfocalmicroscope）是20世紀80年代中期發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應用的新技術(shù)，它是激光、電子攝像和計算機圖像處理等現代高科技手段滲透，并與傳統的光學(xué)顯微鏡結合產(chǎn)生的先進(jìn)的細胞分子生物學(xué)分析儀器，在生物及醫學(xué)等領(lǐng)域的應用越來(lái)越廣泛，已經(jīng)成為生物醫學(xué)實(shí)驗研究的必備工具。
傳統熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標志細胞中的特定結構，不僅圖像與背景的對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(cháng)的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的分辨率；λ為照明光線(xiàn)的波長(cháng)；NA為物鏡的數值孔徑)。但當所觀(guān)察的熒光標本稍厚時(shí)，傳統熒光顯微鏡一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)就顯現出來(lái)：焦平面以外的熒光結構模糊、發(fā)虛。原因是大多數生物學(xué)標本是層次區別的重疊結構(如耳蝸基底膜。其實(shí)是外毛細胞、多種支持細胞、神經(jīng)纖維等組成的空間結構),，在普通光學(xué)顯微鏡下聚焦平面的變化，會(huì )表現出不同的形態(tài)。假若熒光標記的結構在不同層次上都有分布，且重疊在一起，反射熒光顯微鏡(epifluorescentmicroscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來(lái)自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收，熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率就要大大降低。
在傳統光學(xué)顯微鏡基礎上，激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計算機對所觀(guān)察的對象進(jìn)行數字圖像處理觀(guān)察、分析和輸出。其特點(diǎn)是可以對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無(wú)損傷觀(guān)察和分析細胞的三維空間結構。同時(shí)，利用免疫熒光標記和離子熒光標記探針，該技術(shù)不僅可觀(guān)察固定的細胞、組織切片，還可以對活細胞的結構、分子、離子及生命活動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀(guān)察和檢測，在亞細胞水平上觀(guān)察諸如CapH值，膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具，極大地豐富了人們對細胞生命現象的認識。
結構
激光掃描共聚焦顯微鏡
在結構配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統(包括數據采集、處理、轉換、應用軟件)、圖像輸出設備、光學(xué)裝置和共聚焦系統等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學(xué)切片”（Opticalsectioning）、三維重建、動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，因而為基礎醫學(xué)與臨床醫學(xué)的研究提供了有效手段。此外，CLSM對熒光樣品的觀(guān)察具有明顯的優(yōu)勢，只要能用熒光探針進(jìn)行標記的樣品就可用其觀(guān)察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀(guān)察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態(tài)的測量,配合焦點(diǎn)穩定系統可以實(shí)現長(cháng)時(shí)間活細胞動(dòng)態(tài)觀(guān)察。
原理
在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中，整個(gè)標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線(xiàn)照明，圖像可以用肉眼直接觀(guān)察。同時(shí)，來(lái)自焦點(diǎn)以外的其他區域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在2um以上時(shí)，其影響更為明顯。
激光掃描共聚焦顯微鏡
功能特點(diǎn)
應用功能
激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)是近代最先進(jìn)的細胞生物醫學(xué)分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激光熒光探針，利用計算機進(jìn)行圖像處理，不僅可觀(guān)察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結構、分子、離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀(guān)察和檢測。目前，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)已用于細胞形態(tài)定位、立體結構重組、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等研究，并提供定量熒光測定、定量圖像分析等實(shí)用研究手段，結合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細胞生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應用。
組織和細胞中的定量熒光測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標本以單波長(cháng)、雙波長(cháng)或多波長(cháng)模式，對單標記或多標記的細胞及組織標本的共聚焦熒光進(jìn)行數據采集和定量分析，同時(shí)還可以利用沿縱軸上移動(dòng)標本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加，形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結構上的精確定位。常用于原位分子雜交、腫瘤細胞凋亡觀(guān)察、單個(gè)活細胞水平的DNA損傷及修復等定量分析。
細胞間通訊的研究
動(dòng)物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在細胞增殖和分化中起著(zhù)重要作用。激光掃描共聚焦顯微鏡可通過(guò)觀(guān)察細胞縫隙連接分子的轉移來(lái)測量傳遞細胞調控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
細胞物理化學(xué)測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可對細胞形狀、周長(cháng)、面積、平均熒光強度及細胞內顆粒數等參數進(jìn)行自動(dòng)測定。能對細胞的溶酶體、線(xiàn)粒體、內質(zhì)網(wǎng)、細胞骨架、結構性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內特異結構的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時(shí)及定位測定。
激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點(diǎn)信息的有效辨別使在亞細胞水平顯示離子分布成為可能。利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個(gè)細胞內pH和多種離子(Ca、K、Na、Mg)在活細胞內的濃度及變化。一般來(lái)說(shuō)，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測細胞內離子量變化的速度相對較快，但其圖像本身的價(jià)值較低，而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像，這對于研究鈣等離子細胞內動(dòng)力學(xué)有意義。
三維圖像的重建
傳統的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過(guò)對同一樣品不同層面的實(shí)時(shí)掃描成像，進(jìn)行圖像疊加可構成樣品的三維結構圖像。它的優(yōu)點(diǎn)是可以對樣品的立體結構分析，能十分靈活、直觀(guān)地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察，并揭示亞細胞結構的空間關(guān)系。
熒光漂白恢復技術(shù)
該方法的原理是一個(gè)細胞內的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力，而鄰近未被漂白細胞中的熒光分子可通過(guò)縫隙連接擴散到已被漂白的細胞中，熒光可逐漸恢復?？赏ㄟ^(guò)觀(guān)察已發(fā)生熒光漂白細胞其熒光恢復過(guò)程的變化量來(lái)分析細胞內蛋白質(zhì)運輸、受體在細胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細胞生物學(xué)過(guò)程。
長(cháng)時(shí)程觀(guān)察細胞遷移和生長(cháng)
活細胞觀(guān)察通常需要一定的加熱裝置及灌注室，以保持培養液的適宜溫度及CO濃度的恒定。目前的激光掃描共聚焦顯微鏡，其光子產(chǎn)生效率已大大改善，與更亮的物鏡和更小光毒性的染料結合后可以減小每次掃描時(shí)激光束對細胞的損傷，用于數小時(shí)的長(cháng)時(shí)程定時(shí)掃描，記錄細胞遷移和生長(cháng)等細胞生物學(xué)現象。
應用領(lǐng)域
在細胞及分子生物學(xué)基礎研究中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡應用照明針與檢測孔共軛成像，有效抑制了焦外模糊成像并可對標本各層分別成像，對活細胞行無(wú)損傷的“光學(xué)切片”這種功能也被形象的稱(chēng)為“顯微CT”。CLSM還可以對貼壁的單個(gè)細胞或細胞群的胞內、胞外熒光作定位、定性、定量及實(shí)時(shí)分析，并對胞內成分如線(xiàn)粒體、內質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+等的分布、含量等進(jìn)行測定及動(dòng)態(tài)觀(guān)察，使細胞結構和功能方面的研究達到分子水平。
在腫瘤和抗癌藥物篩選研究中的應用
普通顯微鏡及電子顯微鏡，僅能對腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行定性分析，而CLSM則可對單標記或者多標記細胞、組織標本及活細胞進(jìn)行重復性極佳的熒光定量分析，從而對腫瘤細胞的抗原表達、細胞結構特征，抗腫瘤藥物的作用及機制等方面定量化。
在血液病學(xué)和醫學(xué)免疫學(xué)研究中的應用
在大腦和神經(jīng)科學(xué)中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡分層掃描發(fā)現神經(jīng)軸突的內部結構連續性好。用激光掃描共聚焦顯微鏡能觀(guān)察到腦干組織中神經(jīng)軸突的正常走向，可排除在熒光顯微鏡下由此造成的一些病理假象。并且激光掃描共聚焦顯微鏡能觀(guān)察神經(jīng)軸突的三維結構，因此應用CLSM有可能觀(guān)察到普通光鏡下未能發(fā)現的神經(jīng)組織的細微病變。
在眼科研究中的應用
在骨科研究領(lǐng)域中的應用
激光掃描共聚焦顯微鏡在骨科研究領(lǐng)域的應用現狀表明，CLSM在觀(guān)測骨細胞形態(tài)學(xué)研究、骨細胞特異性蛋白（骨鈣素）以及骨細胞之間的相互作用具有顯著(zhù)的優(yōu)勢。
結語(yǔ)
激光掃描共聚焦顯微鏡作為一項全新的實(shí)驗手段和強有力的研究工具，為我們解決一些以往研究工作中不能解決的技術(shù)難題創(chuàng )造了條件，因而必將得到更為廣泛的應用。隨著(zhù)新軟件的不斷開(kāi)發(fā)及各個(gè)學(xué)科的不斷發(fā)展和相互滲透，相信它還將會(huì )有更廣闊的發(fā)展前景。
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