技術(shù)原理

首先通過(guò)PCR擴增含有SNP的基因組片段，然后通過(guò)序列特異性引物實(shí)現單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片基質(zhì)共結晶后在真空管中受瞬時(shí)納秒 (10-9s) 強激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由于電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過(guò)檢測核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點(diǎn)信息。

主要特點(diǎn)

時(shí)間飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測準確率可達99.9%，除了準確性高、靈活性強、通量大、檢測周期短等優(yōu)勢外，最有吸引力的應該還是它的性?xún)r(jià)比。飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺（MALDI-TOF）是國際通用的基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的研究平臺，該方法憑借其科學(xué)性和準確性已經(jīng)成為該領(lǐng)域的金標準。

主要方法

1.Taqman探針?lè )ā♂槍θ旧w上的不同SNP位點(diǎn)分別設計PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴增。探針的5’-端和3’-端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。當溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。

2.SNaPshot法　該技術(shù)由美國應用生物公司（ABI）開(kāi)發(fā)，是基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱(chēng)小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目。在一個(gè)含有測序酶、四種熒光標記ddNTP、緊臨多態(tài)位點(diǎn)5’-端的不同長(cháng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI測序儀檢測后，根據峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對應的SNP位點(diǎn)，根據峰的顏色可得知摻入的堿基種類(lèi)，從而確定該樣本的基因型。對于PCR產(chǎn)物模板可通過(guò)多重PCR反應體系來(lái)獲得。通常用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析。

3.HRM法　高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過(guò)實(shí)時(shí)監測升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結合情況，來(lái)判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì )影響熔解曲線(xiàn)的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)型的局限，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。該方法無(wú)需設計探針，操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，結果準確，并且實(shí)現了真正的閉管操作。

4.Mass Array法　MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò)引物延伸或切割反應與靈敏、可靠的MALDI-TOF-MS技術(shù)相結合，實(shí)現基因分型檢測?；贛assARRAY平臺的iPLEX GOLD技術(shù)可以設計最高達40重的PCR反應和基因型檢測，實(shí)驗設計靈活，分型結果準確性高。根據應用需要，對數十到數百個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行數百至數千份樣本檢測時(shí)，MassARRAY具有最佳的性?xún)r(jià)比，特別適合于對全基因組研究發(fā)現的結果進(jìn)行驗證，或者是有限數量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。

5.Illumina BeadXpress法　采用Illumina公司的BeadXpress系統進(jìn)行批量SNP位點(diǎn)檢測，可以同時(shí)檢測1-384個(gè)SNP位點(diǎn)，往往用于基因組芯片結果確認，適合高通量檢測。微珠芯片具有高密度、高重復性、高靈敏度、低上樣量、定制靈活等特點(diǎn)，極高的集成密度，從而獲得極高的檢測篩選速度，在高通量篩選時(shí)可顯著(zhù)降低成本。