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外顯子捕獲
外顯子捕獲
外顯子捕獲(exon trapping) 是構建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列，從而克隆目的基因。捕獲外顯子的載體pETV—SD是一種反轉錄病毒穿梭載體，即可在不同種生物中如大腸桿菌和酵母，細菌和哺乳動(dòng)物細胞等進(jìn)行復制的載體因為凡是有內含子和外顯子的基因在轉錄后都要經(jīng)過(guò)RNA剪接，這就需要有剪接供體(splicing donor，SD)位點(diǎn)和剪接受體(splicing acceptor，SA)位點(diǎn)。因此，SA位點(diǎn)可作為基因的標志。pETV—咀載體的克隆位點(diǎn)上游有一個(gè)“外顯子捕獲序列”(exon trap cassette)，可用來(lái)識別載體的插入片段中有無(wú)SA位點(diǎn)。
基本信息
| 中文名 | 外顯子捕獲 |
| 外文名 | exon trapping |
| 方法 | 構建一種載體 |
| 目的 | 克隆目的基因 |
操作步驟
(1)基因組DNA經(jīng)“霰彈法”切成小片段后，克隆在位于“外顯子捕獲序列”下游的克隆位點(diǎn)上。
(2)將這些重組載體匯總后感染反轉錄病毒的專(zhuān)宿包裝細胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2細胞系。ψ2細胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體(自身不能合成病毒蛋白質(zhì))成為反轉錄病毒在細胞里增殖。當反轉錄病毒在細胞內轉錄時(shí)，如果插入片段中包含有功能的SA位點(diǎn)，則有可能發(fā)生RNA剪接反應而將IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包裝在病毒子(virion)中，從細胞培養液中收集后用來(lái)感染兼宿反轉錄病毒包裝細胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。這使反轉錄病毒再進(jìn)行一輪復制，并產(chǎn)生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價(jià)病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復制時(shí)則大大提高了RNA剪接的機會(huì )。
基本原理
(5)從COS細胞中回收復制的附加體DNA，經(jīng)限制性?xún)惹忻窪pn I 酶切后轉化細菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培養基上挑選轉化子。盧—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成藍色產(chǎn)物。因此，不產(chǎn)生β—半乳糖苷酶的轉化子菌落則呈白色。
(6)只挑選出白色菌落作進(jìn)一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使夕—半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉錄病毒生活周期的RNA時(shí)期中發(fā)生了剪接反應，從而丟失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(8)如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準確的剪接反應可切除作為標記的IVS，使人口—珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕獲陷阱的插入片段中的外顯子序列連接，這可直接測定其序列加以證明。
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這家伙太懶了，什么都沒(méi)寫(xiě)！
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