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抗原修復
組織在制作過(guò)程中，由于化學(xué)試劑的作用封閉了抗原，又由于熱的作用致使部分抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，致使在免疫組化的染色過(guò)程中不能將其顯示出來(lái)，為了解決上述的問(wèn)題，利用化學(xué)試劑和熱的作用將這些抗原重新暴露出來(lái)或修正過(guò)來(lái)的過(guò)程稱(chēng)為抗原修復。
基本信息
| 中文名 | 抗原修復 |
| 所屬領(lǐng)域 | 化學(xué)生物學(xué) |
基本信息
1.組織在用甲醛固定的過(guò)程中所形成的醛鍵可封閉抗原的決定簇。甲醛與組織蛋白質(zhì)類(lèi)的反應是多樣而復雜的，因為它能和多種不同的功能基團結合，在多數情況下在其間形成橋鍵8。這也是甲醛的一個(gè)作用，因為它是一種聚合固定劑，因而能在相鄰的蛋白質(zhì)鍵間形成橋鍵的作用。
2. 甲醛在保存進(jìn)程中會(huì )形成羥甲基，也可封閉抗原決定簇。據French和Edsall的研究認為，最常遇到的甲醇反應，就是加到一個(gè)含反應性氫原子的化合物中，形成一個(gè)羥甲基化合物。
為了解決上述存在的問(wèn)題，更好地暴露出抗原，將其很好地顯示出來(lái)，目前世界上公認的方法就是必須進(jìn)行抗原修復。
至今為止，抗原修復有許多種方法，在這些方法中，有的是根據抗體的要求來(lái)進(jìn)行，有的是根據抗原的表達程度來(lái)進(jìn)行，我們則對每種病例每項檢測，都要求必須進(jìn)行抗原修復，以達到抗原全面表達的最佳狀態(tài)。
物理化學(xué)試劑抗原修復法
1. 真空負壓抗原修復法：
① 切片脫蠟至水。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
這是一種操作簡(jiǎn)單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點(diǎn)有四：一是各物質(zhì)的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機會(huì )；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發(fā)生變性，又不需要使抗原修復液達到沸騰，不會(huì )導致切片因抗原修復液的沸騰而離開(kāi)載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復制片的麻煩，保證了病理報告的及時(shí)發(fā)生，為病人爭取更多的時(shí)間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進(jìn)行操作；四是可以一次性制作大批的切片。
2.微波輻射抗原修復法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。
⑤待修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色。
該法與上法相比，從實(shí)驗結果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬(wàn)次的快速運動(dòng)產(chǎn)生瞬間熱。當然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達到目的。應用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質(zhì)分子作極性運動(dòng)。促進(jìn)形成的醛鍵斷裂開(kāi)。分子間運動(dòng)所產(chǎn)生的瞬間熱，當達到有效的溫度后，就可導致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點(diǎn)是：產(chǎn)熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復液的沸騰，使用微波爐時(shí)禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。
3.高壓抗原修復法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
⑤待修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。
該法高壓和高熱來(lái)促進(jìn)醛鍵的斷裂，當加熱至開(kāi)鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時(shí)的溫度已達121℃左右。該法被應用于一些較難修復的抗原，經(jīng)多次實(shí)驗認為，該法效果不錯。
4.隔水熱抗原修復法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開(kāi)始計時(shí)，持續40分鐘。
⑤待抗原修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
該法應用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長(cháng)時(shí)間的熱的作用，在早期應用于Er和Pr染色的抗原修復時(shí)，我們的修復時(shí)間為40分鐘，如果達不到這時(shí)間，效果將不理想。
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 將切片放入抗原修復液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計測量溫度，當達92℃后，即可拔離電源，當溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此反復持續至10分鐘左右。
⑤待抗原修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
對各種抗原修復方法的評價(jià)。
該法是在沒(méi)有上述的設備時(shí)才選用的一種方法，當然效果是最差的，因為它只是單靠熱的作用，這是遠遠不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計來(lái)測量溫度，對其溫度不好控制，有時(shí)需要多次關(guān)閉電源來(lái)維持所需的溫度。
抗原修復，必須注意以下問(wèn)題
1、PH值的應用范圍及選擇。
應用于抗原修復的物質(zhì)很多，但至今為止，大家公認的最好的抗原修復液還是檸檬酸鹽緩沖液PH6.0，據多年來(lái)的實(shí)踐認為，該液確實(shí)很好，它適合于大多數的抗原，在常規應用的臨床標記抗體中基本都適用，經(jīng)用該液修復后的抗原表達增強，抗原的定性和定位很理想，結果不錯。但近來(lái)也有文獻報道，應用抗原修復液PH8.0的效果也不錯。
2.抗原修復時(shí)應選擇最佳溫度。
據Masson等研究表明：70℃－90℃的溫度對沒(méi)有經(jīng)固定的蛋白可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白，要使其發(fā)生變性，溫度必須在92℃↑。據實(shí)驗認為溫度在92℃－98℃是合適的，尤其在95℃為最好，這是因為：①這種溫度未達沸騰，切片不容易脫離裁片；②能夠解離和破壞與蛋白交聯(lián)的甲醛醛鍵等，處理時(shí)可以隨意選擇和確定抗原修復的作用時(shí)間。
3.抗原修復時(shí)有效溫度所需持續時(shí)間根據各單位的設備條件以及使用的儀器不同，抗原修復時(shí)在有效的溫度范圍內所持續的時(shí)間也不一樣。例如：真空負壓抗原修復法，當達到預定的溫度和所需的負壓（66.7KPa）后可持續5-10分鐘，微波輻射抗原修復法溫度不好控制，抗原修復液容易沸騰，如果切片附貼任憑其沸騰持續5-10分鐘。如果切片附貼很牢固，為了防止脫片，一發(fā)現抗原液已沸騰，即可關(guān)掉電源，待溫度下降后，又可重開(kāi)電源。如此反復數次，使之持續10分鐘。不過(guò)似這種停停開(kāi)開(kāi)著(zhù)的做法效果不如開(kāi)著(zhù)的，因為開(kāi)著(zhù)的除了熱效應以外，還有足量的微波輻射。應用高壓抗原修復法，當發(fā)現抗原修復液沸騰后，加上壓力閥，出現噴氣后，可持續時(shí)間達2-4分鐘。隔水熱加熱抗原修復法，要特別注意內外液體的溫度，內液指抗原修復液，外指浸泡抗原修復液容器的水，應用時(shí)用溫度計浸入抗原修復液測試，使之保持在有效的溫度（92℃↑）范圍內。持續時(shí)間在40分鐘，電爐加熱抗原修復法，其持續時(shí)間在10分鐘以上。由于效果較差，該法目前較少使用。
4.抗原修復液必須遵循自然降溫規律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的。
抗原修復持續時(shí)間過(guò)后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，決不能為了爭取時(shí)間，強行用冰塊或冷水令其降溫。這是因為當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯(lián)結，要有一個(gè)自然環(huán)境讓其自然放松下來(lái)，隨著(zhù)溫度的降低，它們會(huì )慢慢地恢復原來(lái)的形態(tài)和構型。如果用冰塊和冷水強行令其降溫，松開(kāi)后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來(lái)，恢復不了原有的構型，達不到預想的效果。
5.盡量使用足量的抗原修復液。
抗原修復的方法，都采用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由于產(chǎn)熱快。液體容易揮發(fā)直至干涸。因此，應用于抗原修復的液體，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修復的切片，如果由于液體少而導致切片的干涸，則應丟棄切片，因為熱干涸的切片中的抗原是沒(méi)辦法補救的，因它是一種不可逆的現象。據實(shí)驗認為，用于微波輻射抗原修復的液體，量大可多至1000ml。應用大量的抗原修復液時(shí)，由于它的量較大，可延緩了液體的沸騰時(shí)間，增加了切片受微波輻射的量，對抗原修復將達到徹底。
6.切片必須附貼牢固。
用于抗原修復的切片，必須附貼牢固，否則發(fā)生掉片，則前功盡棄。
化學(xué)試劑抗原修復法
1. 胃蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS沖洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色。
2.胰蛋白酶消化法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④PBS洗3次，1分鐘/次。
⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。
⑥PBS洗3次，2分鐘/次。
⑦后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
評價(jià)：上面介紹了胃蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶的使用方法，因這兩種酶在平常較常被使用，故而專(zhuān)門(mén)進(jìn)行介紹，除此之外，無(wú)有幾種酶如鏈霉蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶菠蘿蛋白酶等也可被用來(lái)消化切片。其用法基本一樣。
現今應用酶來(lái)消化切片，主要是根據抗體的要求來(lái)進(jìn)行的，否則都應用物理化學(xué)試劑抗原修復法來(lái)進(jìn)行。因為酶消化不適合于多數的抗體，效果也沒(méi)有其它方法好，因此臨床上都較少用它。
作好免疫組化染色必須注意的問(wèn)題
I、為達到免疫組織化學(xué)技術(shù)的要求，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化最后結果的判斷時(shí)，?？梢?jiàn)到均勻一片的似非特異性染色的現象，經(jīng)多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴散彌散，腫瘤細胞無(wú)限制的生長(cháng)和生長(cháng)過(guò)速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由于機體的作用，可以被均勻地散布于細胞與細胞間的間質(zhì)，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒(méi)有及時(shí)的固定所引起的。離體的組織不及時(shí)固定，組織就會(huì )自溶，抗原就會(huì )擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，在這段時(shí)間里，有的抗原就可以發(fā)生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由于固定液的滲透需要時(shí)間，當滲入到組織之中時(shí)，中間的細胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著(zhù)發(fā)生擴散，這種現象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除后標本較大，雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液，但固定液要透過(guò)肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間，當固定液發(fā)揮作用時(shí)，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達到免疫組織化學(xué)染色的要求，對于離體的組織盡量快的進(jìn)行固定，有條件的應將其剖開(kāi)，早取材，早固定。
II、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過(guò)厚，才能較好地完成脫水的過(guò)程。如果取材太厚，在較短的時(shí)間內脫水不完全，將可引起一系列的問(wèn)題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導致后來(lái)切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復操作，造成人力物力的浪費，造成病理報告的延期發(fā)出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外，即平整、外觀(guān)好看，還要求適中。
III、切片必須完整、均勻、平展、無(wú)皺折、
應用于免疫組織化學(xué)染色的切片，對切片的質(zhì)量要求較高，切片必須完整，平展、無(wú)汽泡，無(wú)鄒折，這樣有利在染色時(shí)的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現染色不均勻的現象，顏色深淺不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時(shí)，由于汽泡的破裂影響了汽泡周?chē)慕M織，在其周?chē)捎^(guān)察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽(yáng)性，容易引起混淆。
免疫組織化學(xué)染色前的前期準備工作，就是必須對新的載玻片進(jìn)行處理，新的載玻片表面看起來(lái)很干凈，有人認為不需要進(jìn)行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠(chǎng)的載玻片，表面復蓋著(zhù)開(kāi)一層油脂樣的物質(zhì)，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時(shí)甚至過(guò)夜，然后取出，經(jīng)自來(lái)水徹底沖洗后，浸入酒精中達2小時(shí)以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無(wú)水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無(wú)水乙醇洗2次，烘干即可使用。
V、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復時(shí)高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應用于免疫組化染色的切片。由于整個(gè)過(guò)程需經(jīng)幾個(gè)階段的處理，如抗原修復時(shí)抗原修復液的沸騰且需持續十幾分鐘，PBS的反復沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達十幾小時(shí)。因此，對切片的質(zhì)量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進(jìn)行結果是切片掉片嚴重，切片松動(dòng)率占100%。切片究竟烘烤多長(cháng)時(shí)間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至于破壞抗原。幾組實(shí)驗[]診斷P173認為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時(shí)最為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點(diǎn)在60℃左右，組織浸蠟時(shí)，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時(shí)以上，才能達到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗，保存下來(lái)的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時(shí)間烘烤出來(lái)的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達100%，保證了病理診斷的及時(shí)性和準確性。
特需要注意的是，不管是應用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應盡快進(jìn)行染色。如果切片切完后，遲遲不進(jìn)行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會(huì )隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)而逐漸消失，甚至出現假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。
VI、切片脫蠟必須干凈，否則將會(huì )影響免疫組化染色的最后結果。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時(shí)間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì )引起許多弊病，如染色不均勻，陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時(shí)間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時(shí)間要根據季節，室溫和試劑的新鮮程度采用不同脫蠟時(shí)間。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(cháng)，10-20分鐘或更長(cháng)?？傊?，操作時(shí)應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果也會(huì )更好。
VII、必須徹底抑制內源性過(guò)氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內源性過(guò)氧化物酶，尤其在紅細胞，中性粒細胞，單核細胞嗜酸性細胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進(jìn)行處理和抑制，它們將會(huì )在DAB底物的顯色時(shí)，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽(yáng)性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行抑制。當然，對它們進(jìn)行徹底的消除是不行的，因為抑制太厲害，對抗原也會(huì )有相同的抑制作用。氫在抑制內源性過(guò)氧化物酶時(shí)，也要注意對抗原的保護，抑制也只能針對它們中的大部分，在DAB顯色后，顯示出淡黃色，這就足以與真正陽(yáng)性物區別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱(chēng)為1%H2O2，因為市售的H2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關(guān)于H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根據實(shí)驗，認為H2O2甲醇較適合于大多數的情況，因為除了H2O2外，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數情況中，用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿(mǎn)意的結果。
VIII、須適當合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過(guò)程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動(dòng)物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應電荷的組織成分無(wú)特異性地結合（如膠原）。由于這種非特異性結合，將導致標記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽(yáng)性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標記的抗體無(wú)特異性結合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對作適當的保存和配制。
VVI、選擇合適的抗體
至今為止，應用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當中又可分為兩種類(lèi)型。
濃縮型抗體
根據近幾年來(lái)使用的情況認為，它有許多優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處：
①可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規活檢診斷中，有常見(jiàn)的病例，也有罕見(jiàn)的病例，尤其是后者，有時(shí)很長(cháng)時(shí)間才遇到一例，這就給抗體的應用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見(jiàn)病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問(wèn)題，如臨時(shí)購買(mǎi)，則需較長(cháng)的時(shí)間，這樣就會(huì )延誤診斷。實(shí)踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測抗體。當購買(mǎi)抗體后，根據檢測病例的數量，在無(wú)菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟膜封起來(lái)，于－30℃的低溫冰箱中保存，臨用時(shí)取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。
②成本低，價(jià)格較便宜。
它與即用型的抗體相比較，價(jià)格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價(jià)格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計，可標記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價(jià)格150元，可標記30例，每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體，手續較為復雜。
對于新購入的濃縮型的抗體，使用時(shí)必須將稀釋為工作液，才能使用，對于從未用過(guò)的抗體，還必須實(shí)驗其實(shí)際的稀釋度，因為各種抗體，廠(chǎng)家都做了相應的稀釋度的實(shí)驗，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對抗體的稀釋度進(jìn)行實(shí)驗，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結果在1：50上是最佳結果，這就是最佳的稀釋點(diǎn)，如果在這范圍內找不出最佳稀釋點(diǎn)，則應繼續實(shí)驗直到找出最佳稀釋點(diǎn)為止。
④需要配置各型號的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。
即用型抗體
近幾年來(lái)，免疫組化技術(shù)應用的推廣，即用型抗體的應用越來(lái)越受到人們的歡迎，根據幾年來(lái)的使用，認為它有許多優(yōu)點(diǎn)和不足：
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器?，F今的微量加樣器，如為進(jìn)口貨，貴者多達兩千多元。而即用型抗體無(wú)需再行稀釋?zhuān)促I(mǎi)即用，無(wú)需配備其余器械。
④特別適合于基層單位?；鶎訂挝?，無(wú)需多大的投資，就能開(kāi)展免疫組化的工作，這對于提高診斷的準確率，極有好處。
⑤價(jià)格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對于3ml一個(gè)包裝的抗體，一年需要用幾支，這對抗體來(lái)說(shuō)，不會(huì )造成浪費。但如果為較小的單位，一年中標記的病例較少，購買(mǎi)抗體時(shí)也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見(jiàn)的病例，有時(shí)一年也標記不了幾例，這樣就應采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買(mǎi)到的抗體使用期就不可能為一年，因為抗體從生產(chǎn)商到銷(xiāo)售商的手里，需要一定的時(shí)間，如果運氣好的話(huà)，你購買(mǎi)到的抗體，是剛交到銷(xiāo)售商的手里，那么，使用的時(shí)間可能長(cháng)些，但如果在銷(xiāo)售商的手中滯留了一段時(shí)間，抗體的有效使用期就可能不會(huì )太長(cháng)，五個(gè)月、六個(gè)月或者三個(gè)月。如果在有效的時(shí)間內不能使用完。稍為超過(guò)一些時(shí)間還可以，如果時(shí)間過(guò)長(cháng)，就應當丟棄，因為會(huì )影響標記的質(zhì)量。有人抱怨，剛買(mǎi)的抗體標記很好，后來(lái)就漸漸不好了。這是因為隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)，抗體的活性會(huì )逐漸失去生物活性，導致了標記質(zhì)量的下降。
抗體的適應癥
在眾多的抗體中，按它們的實(shí)際使用范圍，把它們分為兩個(gè)類(lèi)：
1. 適合于冰凍切片，涂片，細胞培養片。
2. 適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細胞培養片。
選擇合適的單克隆或多克隆抗體
抗體除了分為上述的兩個(gè)類(lèi)外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。
2. 多克隆抗體，在臨床應用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。
抗體的加入
這看似很簡(jiǎn)單的問(wèn)題，如果處理不好也可導致不同的結果，如果應用自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問(wèn)題：
1. 當PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上PBS存留過(guò)多，將會(huì )稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時(shí)也將影響最后的結果，如假陰性等。
2. 加入的抗體以一滴為佳。
當擦干組織塊周邊多余的PBS后，切片保持著(zhù)一定的濕潤度，此時(shí)加入另外的抗體為最佳時(shí)候，滴入抗體以一滴50μl為好，加入后，輕微地搖勻地覆蓋于切片上，使最后的結果穩定均衡，不至于有的地方有反應，有的地方無(wú)反應。
3. 切片沒(méi)擦好將會(huì )影響加入抗體的質(zhì)量，切片沒(méi)沖洗干凈，沒(méi)擦試好，當加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時(shí)你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個(gè)切片，便會(huì )使勁地加入抗體，此時(shí)的結果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒(méi)達到目的，還浪費抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
選擇合適的孵育時(shí)間
第一抗體的孵育時(shí)間，有較多的使用范圍，應用于臨床檢測抗體的孵育時(shí)間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對于研究性質(zhì)的抗體孵育時(shí)間，也可按照上述的時(shí)間，但也有人提出于4℃冰箱中過(guò)夜孵育，根據我們的經(jīng)驗一般不主張于4℃冰箱中過(guò)夜，原因是：
1.長(cháng)時(shí)間的孵育可以使一些非特異性的物質(zhì)沉淀下來(lái)，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷(xiāo)售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長(cháng)時(shí)間的孵育，也能夠結合得很好。
3.長(cháng)時(shí)間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長(cháng)時(shí)間的孵育，不利于臨床病理報告的發(fā)出。
X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時(shí)就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據選用的抗體來(lái)進(jìn)行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠(chǎng)家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒(méi)有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時(shí)間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進(jìn)行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進(jìn)行。
XI、復合物的使用及孵育時(shí)間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
XII、PBS的沖洗
免疫組化的染色過(guò)程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過(guò)，PBS沖洗的正確與否，也是導致最后結果的關(guān)鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類(lèi)及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內洗，這樣就會(huì )造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機會(huì )。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導致切片的脫落。
3.沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費時(shí)間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實(shí)踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱堿性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來(lái)的使用情況，認為該溶液價(jià)格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個(gè)染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開(kāi)緩沖液?？梢?jiàn)緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿，都將影響染色的結果。下面將介紹有關(guān)方面的內容：
緩沖液的配制
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個(gè)具500ml的容量瓶，稱(chēng)量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時(shí)應注意的事項：
①在配制時(shí)，要先確定NaH2PO4的用量，因為該試劑有許多種類(lèi)形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如Na H2PO4含單個(gè)水分子時(shí)，配制時(shí)要稱(chēng)取13.80g，而當含有2個(gè)水分子時(shí)，則需要稱(chēng)取15.60g。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過(guò)，以防污染，導致溶液中有雪菌生長(cháng)。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
注意事項
①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個(gè)，裝入已稱(chēng)好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
①PH測試筆測試，這是一種簡(jiǎn)便、易行、結果較為準確的測試方法。當配制完P(guān)BS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，小屏幕上將可出現測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來(lái)調校。
②用試紙來(lái)測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時(shí)，測試時(shí)在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，?？科浞磻念伾珌?lái)確定，十分簡(jiǎn)便，一般的試劑都可用它來(lái)測試。
③儀器測試：對于要求較高，需較準確的PH值，須彩用儀器測試。
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時(shí)，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
配置HCL溶液注意事項：
①配制1N HCL時(shí)，如果大量配制，HCL入水時(shí)可產(chǎn)生很大的熱量，對的所用的玻璃器皿應特別小心，以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調校PH值時(shí)，可參考上述的三種方法。
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