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拓撲異構酶
催化DNA鏈的斷裂和結合的酶
拓撲異構酶（topoisomerase）是指通過(guò)切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來(lái)更正DNA連環(huán)數的酶。
基本信息
| 中文名 | 拓撲異構酶 |
| 外文名 | topoisomerase |
| 簡(jiǎn)介 | 存在于細胞核內的一類(lèi)酶 |
| 特點(diǎn) | 能夠催化DNA鏈的斷裂和結合 |
簡(jiǎn)介
拓撲異構酶
臨床使用
這些藥物包括阿霉素（adriamycin）、放線(xiàn)霉素D（actinomycinD）、道諾梅素（daunomycin）、VP-16、VM-26（替尼泊苷teniposide或者表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin）。相對來(lái)說(shuō)，無(wú)論是臨床，還是處在試驗階段的，作為哺乳動(dòng)物異構酶II型毒素的藥物較多
雙-和四苯咪唑（Chen等，CancerRes.1993,53,1332-1335;Sun等,J.Med.Chem.1995,38,3638-3644；Kim等,J.Med.Chem.1996,39,992-998），某些白屈菜生物堿（benzo[c]phenanthridine）和原小檗堿類(lèi)生物堿（protoberberine）與合成的類(lèi)似體（Makhey等，Med.Chem.Res.1995,5,1-12； Janin等，J.Med.Chem.1975，18，708-713；Makhey等，Bioorg.&Med.Chem.1996,4,781-791），以及bulgerain（Fujii等,J.Biol.Chem.1993，268，），saintopin（Yamashita等，Biochemistry1991，30，5838-5845）和indolocarbazoles(Yamashita等，Biochemistry1992，31，12069-12075)。
其他被確定的拓撲異構酶毒素則包括某些白屈菜生物堿（benzophenanthridine）和cinnoline化合物（見(jiàn)LaVoie等，美國專(zhuān)利6140328，以及WO01/32631）。盡管這些化合物大有用途，但是由于其較低的溶解性使得他們的應用受到限制。
2006年1月下旬，美國專(zhuān)利局連續授予了美國新澤西大學(xué)關(guān)于以拓撲異構酶（topoisomerase）為作用靶位的氨基和硝基替代類(lèi)藥物的合成及應用的四個(gè)專(zhuān)利。
分類(lèi)
可分為兩類(lèi)一類(lèi)叫拓撲異構酶I，一類(lèi)叫拓撲異構酶II。拓撲異構酶I催化DNA鏈的斷裂和重新連接，每次只作用于一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈的斷裂和連接，它們不需要能量輔因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓撲異構酶I又稱(chēng)ω蛋白，大白鼠肝DNA拓撲異構酶I又稱(chēng)切刻-封閉酶(nicking-closing enzyme )。拓撲異構酶II能同時(shí)斷裂并連接雙股DNA鏈．它們通常需要能量輔因子ATP。在拓撲異構酶II中又可以分為兩個(gè)亞類(lèi)：一個(gè)亞類(lèi)是DNA旋轉酶(DNA gyrase )，其主要功能為引入負超螺旋，在DNA復制中起十分重要的作用。迄今為止，只有在原核生物中才發(fā)現DNA旋轉酶．另一個(gè)亞類(lèi)是轉變超螺旋DNA(包括正超螺旋和負超螺旋)成為沒(méi)有超螺旋的松弛形式(relaxed form )。這一反應雖然是熱力學(xué)上有利的方向，但不知道為什么它們仍然像DNA旋轉酶一樣需要ATP，這可能與恢復酶的構象有關(guān)。這一類(lèi)酶在原核生物和真核生物中都有發(fā)現。
第一類(lèi)
DNA拓撲異構酶能催化的反應很多，這里只能作簡(jiǎn)單敘述。DNA拓撲異構酶I對單鏈DNA的親和力要比雙鏈高得多，這正是它識別負超螺旋DNA的分子基礎，因為負超螺旋DNA常常會(huì )有一定程度的單鏈區。負超螺旋越高，DNA拓撲異構酶I作用越快?，F已知道，生物體內負超螺旋穩定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過(guò)拓撲異構酶1和II的相反作用而使負超螺旋達到一個(gè)穩定狀態(tài)?，F已發(fā)現，編碼E．coli拓撲異構酶I的基因topA發(fā)生突變，則會(huì )引起旋轉酶基因的代償性突變；否則，負超螺旋增高，細胞生活能力降低。拓撲異構酶I作用的堿基序列特異性不高，但切點(diǎn)一定在C的下游方向4個(gè)堿基(包括C本身)的位置。在將DNA單鏈切斷后，拓撲異構酶I連接于切口的5端，并貯藏了水解磷酸二脂鍵的能量用以連接切口，因而拓撲異構酶I的作用不需能量供應。此外．拓撲異構酶I還能促進(jìn)兩個(gè)單鏈環(huán)的復性，其作用是解除復性過(guò)程所產(chǎn)生的鏈環(huán)數的負值壓力，以使復性過(guò)程進(jìn)行到底。如果在一個(gè)單鏈環(huán)上一個(gè)部位切斷，而使另一部位繞過(guò)切口．則可產(chǎn)生三葉結結構分子 (trefoil knot)。如果有兩個(gè)雙鏈環(huán)，其中一個(gè)有一個(gè)切刻，拓撲異構酶1則可以將切刻對面的一條鏈切斷，伎完整的雙鏈環(huán)套進(jìn)去，再連接起來(lái)而成為環(huán)連體分子(catenane)，以上這三種反應示于右圖。拓撲異構酶I還能催化其他反應，這將在復制和重組的機制中再講述。
第二類(lèi)
大腸桿菌的拓撲異構酶II(gyrase)除了引入負超螺旋以外．還具有形成或拆開(kāi)雙鏈DNA環(huán)連體和成結分子的能力。II類(lèi)拓撲異構酶沒(méi)有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對雙鏈DNA結合。DNA旋轉酶有兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基。α亞基約105KDa，為gyrA基因所編碼，具有磷酸二脂酶活性，可為萘啶酮酸(nalidixic acid )所抑制。A亞基約95KD，為graB基因所編碼，具有ATP酶活性，可為新生霉素(novobiocin )所抑制。這兩種藥物均可抑制野生型大腸桿菌的DNA復制?？梢?jiàn)DNA旋轉酶為E．coli的復制所不可缺少的。在切斷一條DNA雙鏈后，兩個(gè)a亞基各結合于切口的一個(gè)5'端，并貯藏了水解磷酸二酯鍵而獲得的能量，由于該酶的整體性，因而DNA鏈的四個(gè)斷頭并無(wú)任意旋轉的可能性。由于酶的別構效應，使完整的雙鏈穿過(guò)切口，然后再重新形成磷酸二酯鍵。β亞基的功能在于水解ATP以使酶分子恢復原來(lái)的構象，以便進(jìn)行下一輪反應。這一點(diǎn)可以用ATP的同系物β,γ-亞氨基ATP代替ATP而得到證實(shí)。因為這一同系物不能被DNA旋轉酶所水解，但它確能促進(jìn)第一輪拓撲異構反應，使負超螺旋增加，而妨礙以后進(jìn)一步的拓撲異構反應。
化學(xué)反應
DNA拓撲異構酶催化反應
很多，其反應本質(zhì)是先切斷DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA的鏈環(huán)數之后再連接之，兼具DNA內切酶和DNA連接酶的功能．然而它們并不能連接事先已經(jīng)存在的斷裂DNA，也就是說(shuō)，其斷裂反應與連接反應是相互耦聯(lián)的。拓撲異構酶（包括Ⅰ型和II型）都可以用符號轉化模型進(jìn)行解釋?zhuān)ㄏ聢D左中）
除了DNA拓撲異構酶可以產(chǎn)生異構變化以外，很多能夠嵌入相鄰堿基之間影響堿基堆集作用的試劑，特別是片狀的染料分子．也能改變DNA的拓撲狀態(tài)，最明顯的例子就是溴化乙錠(ethidium bromide)。例如以SV40的CCC分子與溴化乙錠的結合試驗為例，當沒(méi)有染料時(shí)，此DNA為負超螺旋，具有較高的沉降常數(21S)；當加入染料分子與核苷酸之比為0.05時(shí)，沉降數降至l6S，此時(shí)DNA為沒(méi)有超螺旋的松弛形式；當染料分子和核苷酸的比值增加到0.09時(shí)，沉降常數又上升到大約21S，此時(shí)DNA分子為正超螺旋。這種關(guān)系如上圖右所示，不過(guò)要注意的是，溴化乙錠并沒(méi)有改變Lk值，只不過(guò)是由溴化乙錠分子的嵌入，增加了局部DNA二級結構的緊纏狀態(tài)。因而，隨著(zhù)嵌入染料分子數的增多，起初表現為負超螺旋的減少與消失，隨后便是正超螺旋的增加。這與單鏈DNA結合蛋白促進(jìn)負超螺旋轉變?yōu)榕轄罱Y構的情況是類(lèi)似的。
DNA拓撲異構酶（DNA topoisomerase）
為催化DNA拓撲學(xué)異構體相互轉變的酶之總稱(chēng)。催化DNA鏈斷開(kāi)和結合的偶聯(lián)反應，為了分析體外反應機制，用環(huán)狀DNA為底物。在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓撲學(xué)轉變中，要暫時(shí)的將DNA的一個(gè)鏈或兩個(gè)鏈切斷，根據異構體化的方式而分為二個(gè)型。切斷一個(gè)鏈而改變拓撲結構的稱(chēng)為Ⅰ型拓撲異構酶（top- oisomeraseⅠ），通過(guò)切斷二個(gè)鏈來(lái)進(jìn)行的稱(chēng)為Ⅱ型拓撲異構酶（topoisomeraseⅡ）。屬于Ⅰ型的拓撲異構酶，有大腸桿菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11萬(wàn)的單個(gè)多肽鏈所成）及各種真核細胞中存在的切斷-結合酶（nicking-closing enzyme，分子量約6萬(wàn)5千—7萬(wàn)的及分子量約10萬(wàn)的）。Ⅱ型拓撲異構酶，有存在于細菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓撲異構酶Ⅱ以及真核細胞中依賴(lài)ATP的拓撲異構酶Ⅱ等。另外，噬菌體λ的irt基因產(chǎn)物和噬菌體φX174的基因A的產(chǎn)物等也具有切斷—結合酶的活性，可認為是拓撲異構酶之一種。Ⅰ型拓撲異構酶不需要ATP的能量而催化異構體化，作為反應的中間產(chǎn)物，在原核生物來(lái)說(shuō)是游離型的5′-OH末端扣3′-磷酸末端與酶形成共價(jià)鍵，而真核生物是3′-OH末端5′-磷酸末端與酶形成共價(jià)鍵。此酯鍵中所貯存的能量，可能在切斷端的再結合上起著(zhù)作用。Ⅰ型拓撲異構化酶催化的反應有下列各種：使超螺旋DNA在每一切斷—結合反應中，使L數（參見(jiàn)DNA拓撲學(xué)異構體）發(fā)生一種變化，即松弛（relaxation）。將互補的單鏈環(huán)狀DNA轉變成具有螺旋結構的雙鏈環(huán)狀DNA，使單鏈DNA打結（topological knot）或解結。另外在二個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA一個(gè)分子的一個(gè)鏈切斷時(shí)，形成鏈環(huán)狀二聚體的分子（ca-tenane）。在Ⅱ型拓撲異構酶中，DNA促旋酶可單獨催化閉環(huán)狀DNA產(chǎn)生超螺旋，這是獨特的。其它二個(gè)型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，還可催化促旋酶的催化反應。真核細胞的拓撲異構酶Ⅰ，參與核小體的形成，細菌的ω蛋白參與轉錄和某種轉位子的插入。促旋酶和T4拓撲異構酶Ⅱ參與DNA的復制和轉錄過(guò)程。
DNA 拓撲異構酶 I （DNA Topoisomerase I）催化4種反應：
①超螺旋的松弛；
②繩結(knot)的形成；
③環(huán)狀雙鏈分子的形成；
④環(huán)狀雙鏈分子的連接。本酶由于來(lái)源于小牛胸腺，與來(lái)源于原核生物的酶性質(zhì)不同，即使在Mg2+不存在的條件下也顯示活性。而且，原核生物由來(lái)的DNA Topoisomerase I 只作用負鏈的超螺旋分子，而本酶則能使正負兩方的超螺旋分子均形成松散型。
用途
DNA的結構轉換和解析
Ⅱ型拓撲異構酶
Ⅱ型拓撲異構酶巧妙地執行了打開(kāi)DNA雙螺旋的過(guò)程。它將DNA的一個(gè)雙螺旋結構切開(kāi)，并讓另一個(gè)螺旋從缺口處穿過(guò)，在此之后一個(gè)雙螺旋便被打開(kāi)。這里顯示的圖片是由兩個(gè)蛋白構建的：這個(gè)編號為1bgw的蛋白具有拓撲異構酶的下半部分結構，另外一個(gè)編號為1eil的蛋白來(lái)自于一個(gè)旋轉酶的結構域，它與拓撲異構酶的上部很相似。拓撲異構酶具有很高的催化活性，它具有一些類(lèi)似于“門(mén)”的結構，控制著(zhù)DNA進(jìn)入到其上面的兩個(gè)裂口內。此處用紅色顯示的兩個(gè)酪氨酸與DNA鏈相結合并形成共價(jià)鍵，并且這種緊密的結合方式直到DNA重新恢復為止。
作用
新發(fā)現
DNA螺旋與拓撲異構酶相互作用的新發(fā)現
一個(gè)荷蘭人領(lǐng)導的國際性研究組在分子水平上破解了自然釋放DNA中積累起來(lái)的扭曲張力的機制。來(lái)自Delft理工大學(xué)、Ecole Normale Superieure和Sloan-Kettering研究所的研究人員將他們的發(fā)現公布在3月31日的《自然》雜志上，并成為這一期雜志的封面。
IB型拓撲異構酶能夠釋放DNA鏈中積累的扭力。研究過(guò)程中，研究人員能夠在分子水平上跟蹤一個(gè)單個(gè)的拓撲異構酶分子一段時(shí)間內在單個(gè)DNA分子上的活動(dòng)。拓撲異構酶能夠夾著(zhù)DNA、切開(kāi)兩個(gè)DNA鏈中的一個(gè)并使DNA在與粘性末端重新結合在一起前變得舒展。在靈敏的檢測儀器的幫助下，研究人員能夠測量不同參數，如在酶空腔中的旋轉的DNA的摩擦力。這項研究對DNA和這種酶之間的相互作用有了新的了解。
DNA的兩個(gè)單鏈紐在一起并形成雙螺旋結構，而雙鏈的堿基對序列儲存著(zhù)遺傳信息。在細胞分裂過(guò)程中，遺傳物質(zhì)被復制并且負責復制的酶必須能夠將這些堿基序列轉錄。但是要實(shí)現這個(gè)過(guò)程就必須將需要轉錄的DNA部分變直。這種纏繞和舒展共存的DNA分子中產(chǎn)生了扭力，其扭力的大小隨著(zhù)細胞分裂過(guò)程的發(fā)展而增加。這種力能夠延遲細胞分裂過(guò)程并且在一些情況下甚至終止分裂，而IB型拓撲異構酶則能減少這些扭力。
這種酶釋放DNA扭力的步驟如下：拓撲異構酶先像夾子一樣夾住雙鏈DNA，然后瞬時(shí)穿過(guò)兩條DNA鏈中的其中一條。DNA分子中積累的這種扭力然后在完整鏈附近被消磨掉。在旋轉之后，這種酶再次緊緊抓住旋轉的DNA并將斷裂的鏈重新粘連起來(lái)。研究人員能夠測定出這種拓撲異構酶在剪切和粘連過(guò)程之間卸掉的超螺旋的確切數目。
IB型拓撲異構酶工作的精確機制還對癌癥研究有重要意義。能夠抑制IB拓撲異構酶功能的藥物已在臨床上有所使用，但它們的使用可能在獲得這些發(fā)現后得到改善。
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